Gladys Georgianna Greene voit le jour le 17 octobre 1900 à Plattsburgh, dans l'État de New York aux États-Unis. Issue d'une famille modeste, la jeune fille grandit en déménageant fréquemment au gré des emplois de son père photographe, pour finalement s'installer à New York. C'est dans la métropole américaine qu'elle commence sa carrière professionnelle comme mannequin, avant de tenter sa chance dans le monde du spectacle sous le pseudonyme de Jean Arthur, un nom inspiré par ses deux héros historiques, Jeanne d'Arc et le roi Arthur.

Ses débuts au cinéma à l'époque du muet, au début des années 1920, s'avèrent laborieux et peu mémorables. Embauchée par les studios Fox, elle est cantonnée à des rôles secondaires dans des films mineurs et des westerns de série B qui ne mettent pas en valeur son potentiel. Frustrée par ce manque de reconnaissance et peu à l'aise avec la superficialité d'Hollywood, elle prend la décision courageuse de quitter la Californie pour retourner à New York afin d'apprendre le métier de comédienne sur les planches de Broadway.

Le tournant de sa carrière coïncide avec l'avènement du cinéma parlant, une révolution technologique qui va paradoxalement révéler son plus grand atout. Sa voix, caractérisée par un timbre légèrement rauque, haut perché et brisé, devient immédiatement sa marque de fabrique. De retour à Hollywood, elle est repérée par les grands studios qui voient en elle l'incarnation parfaite de l'héroïne moderne des années 1930 : une femme moderne, intelligente, travailleuse et profondément humaine.

C'est sa collaboration avec le réalisateur Frank Capra qui la propulse définitivement au rang de star internationale. Elle incarne magistralement la journaliste cynique mais au grand cœur dans L'Extravagant Mr. Deeds en 1936, face à Gary Cooper, puis réitère son triomphe dans Vous ne l'emporterez pas avec vous et surtout dans Monsieur Smith au Sénat en 1939 aux côtés de James Stewart. Elle devient l'égérie de la comédie américaine de l'époque de la Grande Dépression, symbolisant l'intégrité et le bon sens populaire face à la corruption.

Au sommet de sa gloire, elle se distingue des autres vedettes hollywoodiennes par une timidité maladive et un refus catégorique de se plier au jeu de la publicité et des interviews. Souffrant d'un terrible trac avant chaque prise, elle fuit les mondanités et entretient des relations notoirement conflictuelles avec les patrons de studios, notamment Harry Cohn de la Columbia, pour défendre son indépendance artistique. Elle obtient néanmoins une consécration critique en 1943 avec une nomination à l'Oscar de la meilleure actrice pour son rôle dans Plus on est de fous.

Après avoir honoré son contrat avec la Columbia, elle choisit de s'éloigner des plateaux de tournage dès le milieu des années 1940, lassée par la pression de l'industrie cinématographique. Elle fait un retour mémorable et unique sur grand écran en 1953 dans le western crépusculaire L'Homme des vallées perdues de George Stevens, où elle livre une prestation d'une grande sensibilité qui sera son dernier rôle au cinéma. Elle se consacre ensuite de manière sporadique au théâtre et à l'enseignement de l'art dramatique dans de prestigieuses universités.

Elle se retire définitivement dans sa propriété de Carmel-by-the-Sea, sur la côte californienne, où elle mène une existence paisible, recluse et protectrice de sa vie privée, entourée de ses animaux et loin de la nostalgie de l'âge d'or d'Hollywood. Sa discrétion absolue durant ses décennies de retraite contribue à entourer sa personnalité d'une aura de mystère, tandis que ses films continuent de séduire les nouvelles générations de cinéphiles.

L'actrice s'éteint le 19 juin 1991 à Carmel-by-the-Sea, à l'âge de 90 ans, des suites d'une crise cardiaque. Conformément à ses dernières volontés et à son désir constant de simplicité, aucune cérémonie officielle n'est organisée pour ses obsèques. Son corps est incinéré et ses cendres sont dispersées au large des côtes de Carmel, dans l'océan Pacifique, privant ainsi l'ancienne star d'une sépulture physique mais inscrivant son souvenir dans la nature sauvage qu'elle affectionnait tant.